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基質金屬蛋(dan)白酶（MMP-8）ELISA 試劑盒

⒈　正(zheng)式(shi)(shi)試驗(yan)時，應(ying)分別以(yi)陽性(xing)對照與(yu)陰性(xing)對照控制(zhi)試驗(yan)條(tiao)件，待檢樣品(pin)應(ying)作一式(shi)(shi)二(er)份，以(yi)保證實驗(yan)結果的準確性(xing)。有時本底較(jiao)高，說明(ming)有非特(te)異(yi)性(xing)反應(ying)，可(ke)采用羊血清、兔(tu)血清或BSA等封閉。

⒉　在(zai)ELISA中，進行(xing)各項實驗條件的選擇是(shi)很重要(yao)的，其中包括：

⑴　固相(xiang)載體(ti)的選擇：許多(duo)物質可(ke)作為固相(xiang)載體(ti)，如聚(ju)(ju)氯(lv)乙(yi)(yi)烯、聚(ju)(ju)苯乙(yi)(yi)烯、聚(ju)(ju)丙(bing)酰胺和(he)纖維素(su)等(deng)。其(qi)(qi)形式可(ke)以是(shi)凹(ao)(ao)孔(kong)平板(ban)、試管、珠粒等(deng)。當前常用的是(shi)40孔(kong)聚(ju)(ju)苯乙(yi)(yi)烯凹(ao)(ao)孔(kong)板(ban)。不管何(he)種載體(ti)，在(zai)使用前均可(ke)進行(xing)篩選：用等(deng)量抗原包被，在(zai)同一(yi)(yi)實(shi)驗(yan)條件下進行(xing)反應(ying)，觀(guan)察其(qi)(qi)顯色反應(ying)是(shi)否均一(yi)(yi)性(xing)，據此判明(ming)其(qi)(qi)吸附性(xing)能是(shi)否良好。

⑵ 包(bao)被抗體（或(huo)抗原(yuan)）的選擇：將抗體（或(huo)抗原(yuan)）吸(xi)附(fu)在固相(xiang)載體表面時，要求純度(du)(du)要好，吸(xi)附(fu)時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸(xi)附(fu)溫度(du)(du)，時間及(ji)其(qi)(qi)蛋(dan)白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24小時。蛋(dan)白質(zhi)包(bao)被的適濃度(du)(du)需進行滴定：即用不同的蛋(dan)白質(zhi)濃度(du)(du)（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包(bao)被后(hou)，在其(qi)(qi)它試(shi)驗條(tiao)件相(xiang)同時，觀察陽性標(biao)本的OD值。選擇OD值大而蛋(dan)白量少的濃度(du)(du)。對于多數蛋(dan)白質(zhi)來說(shuo)通常(chang)為(wei)1～10μg/ml。

⑶　酶標(biao)(biao)記抗體(ti)工(gong)(gong)作(zuo)濃(nong)度的(de)選擇(ze)：首先用直接ELISA法進行初步效價(jia)的(de)滴定(ding)(ding)（見酶標(biao)(biao)記抗體(ti)部份）。然后再固(gu)定(ding)(ding)其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品(pin)的(de)參考品(pin)及酶標(biao)(biao)記抗體(ti)分(fen)別為不同的(de)稀釋(shi)度）在正式實驗系統里準確地(di)滴定(ding)(ding)其工(gong)(gong)作(zuo)濃(nong)度。

⑷　酶的(de)(de)(de)底物(wu)(wu)及(ji)供(gong)氫體的(de)(de)(de)選擇(ze)：對供(gong)氫體的(de)(de)(de)選擇(ze)要求是價廉、安全、有明顯地顯色反(fan)應，而本身無色。有些供(gong)氫體（如OPD等）有潛(qian)在的(de)(de)(de)致癌作用(yong)(yong)(yong)，應注意(yi)防護。有條件者應使用(yong)(yong)(yong)不致癌、靈敏度(du)高的(de)(de)(de)供(gong)氫體，如TMB和ABTS是當前(qian)較為(wei)滿意(yi)的(de)(de)(de)供(gong)氫體。底物(wu)(wu)作用(yong)(yong)(yong)一段時間后(hou)，應加入強(qiang)酸或強(qiang)堿以終止反(fan)應。通常底物(wu)(wu)作用(yong)(yong)(yong)時間，以10-30分鐘為(wei)宜(yi)。底物(wu)(wu)使用(yong)(yong)(yong)液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用(yong)(yong)(yong)前(qian)加入。

基質金(jin)屬蛋(dan)白(bai)酶(mei)（MMP-8）ELISA 試劑盒

間接法

間接法常用于檢測抗體，一般的(de)操(cao)作步驟為：

1. 將已知的(de)抗(kang)原(yuan)固著于塑膠孔盤(pan)上，完(wan)成后洗去多余的(de)抗(kang)原(yuan)。

2. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的(de)一次(ci)抗(kang)體，則其會與塑膠孔盤(pan)上的(de)抗(kang)原進(jin)行專一性(xing)鍵結。

3. 洗去多余待測檢體，加入帶有酶的(de)二次抗(kang)體，與待測的(de)一次抗(kang)體鍵結。

4. 洗(xi)去多余未鍵結二次抗體，加入酶(mei)底物使酶(mei)呈色，藉儀器(qi)（ELISA reader）測(ce)定(ding)塑膠盤中的(de)吸光值（OD值），以評(ping)估(gu)有色終產物的(de)含量(liang)即可測(ce)量(liang)待測(ce)抗體的(de)含量(liang)。

操作程(cheng)序

1.   分別設空白孔（空白對(dui)照(zhao)孔不加(jia)樣(yang)品(pin)(pin)及酶標(biao)試劑，其余各步操作相同）、標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)孔、待測樣(yang)品(pin)(pin)孔。在酶標(biao)包(bao)被(bei)板(ban)上標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)孔中加(jia)入(ru)標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)50μl；在(zai)酶標包被(bei)板上待測(ce)樣品孔中先加樣品稀(xi)釋(shi)液(ye)40μl，然(ran)后再加待測樣品(pin)10μl（樣品zui終(zhong)稀釋(shi)度(du)為5倍）。每(mei)孔加入酶標試劑50μl，空白(bai)孔除外(wai)。輕輕晃動混勻，37℃溫育60分鐘。

2.   棄去液(ye)體(ti)，甩(shuai)干，每孔加滿稀釋后洗滌液(ye)，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸(xi)水(shui)紙拍干。如(ru)此重復5次，拍(pai)干(gan)。

3.   每孔先加入(ru)顯色劑A50μl，再加(jia)入顯色劑B50μl，輕(qing)輕(qing)震蕩混(hun)勻，37℃避(bi)光顯(xian)色(se)15分(fen)鐘.

4.   取出酶標板，每孔加終止液50μl，終(zhong)止反應（此時藍色立轉黃色）。

5.   測定：以空白孔調(diao)零，在450nm波長下測(ce)量(liang)各孔(kong)的吸光度值（OD值）。 測定應在加終止液(ye)后(hou)15分鐘以內進行。

6.   根據(ju)標準品的(de)濃度(du)及對應的(de)OD值計算出標準曲(qu)線的(de)直(zhi)線回歸方程(cheng)，再(zai)根(gen)據樣品(pin)的(de)OD值在回歸方(fang)程上計(ji)算出對應的(de)樣品(pin)濃(nong)度(du)。也可以(yi)使用各種應用軟件來計(ji)算。應記住由(you)于(yu)樣品(pin)稀(xi)釋了的(de)，其實際濃(nong)度(du)應該乘以(yi)總稀(xi)釋倍數(shu)。