詳細(xi)請咨(zi)詢銷售(shou)人(ren)員：

基質(zhi)金屬(shu)蛋(dan)白酶(mei)（MMP-2）ELISA 試劑盒

雙抗體夾心法

雙抗體夾心法(fa)是檢(jian)測(ce)抗原常用(yong)的方(fang)法(fa)，操(cao)作步(bu)驟如下：

雙抗體(ti)夾心(xin)法

一、將特異性(xing)抗體(ti)與固相載體(ti)連接，形成固相抗體(ti)：洗(xi)滌除(chu)去(qu)未結(jie)合的(de)抗體(ti)及雜質。

二、加受檢標本：使之與固相(xiang)抗體(ti)接觸(chu)反應(ying)一段時(shi)間，讓標本中的(de)抗原(yuan)與固相(xiang)載體(ti)上(shang)的(de)抗體(ti)結合(he)，形成固相(xiang)抗原(yuan)復(fu)合(he)物。洗滌除去其他未結合(he)的(de)物質。

三、加(jia)酶(mei)(mei)(mei)標(biao)抗(kang)體：使固(gu)相(xiang)免(mian)疫復合物(wu)(wu)上的(de)(de)抗(kang)原與酶(mei)(mei)(mei)標(biao)抗(kang)體結合。*洗滌未(wei)結合的(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)標(biao)抗(kang)體。此時固(gu)相(xiang)載體上帶有的(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)量(liang)與標(biao)本中受檢物(wu)(wu)質的(de)(de)量(liang)正相(xiang)關。

四、加底物(wu)：夾(jia)心式復合物(wu)中的(de)(de)酶(mei)催化底物(wu)成為有色(se)產物(wu)。根據顏(yan)色(se)反應(ying)的(de)(de)程度進行該抗原的(de)(de)定性或定量。

根據同(tong)樣(yang)原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和(he)酶標(biao)抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測(ce)定標(biao)本中的抗體(ti)。

在臨床檢(jian)驗中，此法(fa)適用于(yu)(yu)檢(jian)驗各種(zhong)蛋(dan)白(bai)質(zhi)等大(da)分(fen)子抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)，例如(ru)HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要(yao)獲(huo)得針(zhen)對受檢(jian)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)的異(yi)性抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)，就可用于(yu)(yu)包被(bei)固(gu)相載體(ti)(ti)和制(zhi)備酶(mei)(mei)結合物(wu)而建立(li)此法(fa)。如(ru)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)的來源(yuan)為抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)血清(qing)，包被(bei)和酶(mei)(mei)標(biao)(biao)用的抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)好分(fen)別取自不(bu)同種(zhong)屬的動物(wu)。如(ru)應用單克隆抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)，一(yi)(yi)般選擇兩(liang)個針(zhen)對抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)上不(bu)同決定簇(cu)的單抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)，分(fen)別用于(yu)(yu)包被(bei)固(gu)相載體(ti)(ti)和制(zhi)備酶(mei)(mei)結合物(wu)。這種(zhong)雙位點夾心法(fa)具有很高(gao)的特異(yi)性，而且可以將(jiang)受檢(jian)標(biao)(biao)本和酶(mei)(mei)標(biao)(biao)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)一(yi)(yi)起保(bao)溫反應，作一(yi)(yi)步法(fa)檢(jian)測(ce)。

在(zai)一(yi)步法測(ce)定中(zhong)，當標本中(zhong)受(shou)檢(jian)抗(kang)原(yuan)的(de)(de)含量很高時(shi)，過(guo)量抗(kang)原(yuan)分別和(he)固相抗(kang)體及(ji)酶標抗(kang)體結合，而(er)不再形成"夾心復合物"。類(lei)同于沉淀反(fan)應中(zhong)抗(kang)原(yuan)過(guo)剩(sheng)的(de)(de)后(hou)帶現象，此時(shi)反(fan)應后(hou)顯色(se)的(de)(de)吸光(guang)值（位于抗(kang)原(yuan)過(guo)剩(sheng)帶上）與(yu)標準曲線（位于抗(kang)體過(guo)剩(sheng)帶上）某一(yi)抗(kang)原(yuan)濃度的(de)(de)吸光(guang)值相同，如按常法測(ce)讀，所得結果將低于實際的(de)(de)含量，這種現象被稱(cheng)為(wei)鉤(gou)(gou)狀效應（hook effect），因(yin)為(wei)標準曲線到達高峰后(hou)呈鉤(gou)(gou)狀彎落(luo)。鉤(gou)(gou)狀效應嚴重時(shi)，反(fan)應甚至可不顯色(se)而(er)出現假(jia)陰性(xing)結果。因(yin)此在(zai)使用一(yi)步法試(shi)劑(ji)測(ce)定標本中(zhong)含量可異常增高的(de)(de)物質（例如血清中(zhong)HBsAg、AFP和(he)尿液(ye)hCG等）時(shi)，應注意可測(ce)范圍的(de)(de)高值。用高親和(he)力的(de)(de)單(dan)克隆(long)抗(kang)體制備此類(lei)試(shi)劑(ji)可削弱鉤(gou)(gou)狀效應。

假(jia)使在(zai)被測(ce)分(fen)子(zi)的(de)不同(tong)(tong)位點上含有多個(ge)相同(tong)(tong)的(de)決(jue)定(ding)簇(cu)，例如HBsAg的(de)a決(jue)定(ding)簇(cu)，也可用(yong)針對此決(jue)定(ding)的(de)同(tong)(tong)一單抗(kang)分(fen)別包(bao)被固相和制(zhi)備酶(mei)結合(he)物(wu)。但在(zai)HBsAg的(de)檢測(ce)中應注意亞(ya)型(xing)問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個(ge)亞(ya)型(xing)，顯然每種亞(ya)型(xing)均有相同(tong)(tong)的(de)a決(jue)定(ding)簇(cu)的(de)反應性，這也是用(yong)單抗(kang)作夾心(xin)法應注意的(de)問題。

雙抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)夾心法(fa)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)原的(de)(de)另一(yi)注意點是(shi)類風濕因子(zi)（RF）的(de)(de)干擾。RF是(shi)一(yi)種自身(shen)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)，多(duo)為IgM型，能和多(duo)種動物IgG的(de)(de)Fc段(duan)結(jie)合(he)。用作雙抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)夾心法(fa)檢測(ce)(ce)的(de)(de)血清(qing)標(biao)本中如含有RF，它可充當抗(kang)(kang)(kang)原成份，同時與固(gu)相(xiang)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)和酶標(biao)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)結(jie)合(he)，表現出假(jia)陽性反應。采用F（ab'）或Fab片段(duan)作酶結(jie)合(he)物的(de)(de)試劑，由于去除(chu)了Fc段(duan)，從(cong)而可消除(chu)RF的(de)(de)干擾。雙抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)夾心法(fa)ELISA試劑是(shi)否受RF的(de)(de)影響，已(yi)被(bei)列為這類試劑的(de)(de)一(yi)項考(kao)核(he)指標(biao)（參見6.2）。

雙抗體夾心法適用于測(ce)定二(er)價(jia)或二(er)價(jia)以(yi)上的大分子抗原，但不適用于測(ce)定半抗原及小分子單價(jia)抗原，因其不能(neng)形成兩(liang)位(wei)點夾心。

雙抗原夾心法測抗體

反應(ying)模式與雙抗(kang)(kang)體夾心法(fa)(fa)類(lei)似。用(yong)特異性(xing)抗(kang)(kang)原進行(xing)包被和(he)制備酶(mei)結合物(wu)，以檢測相(xiang)應(ying)的(de)抗(kang)(kang)體。與間接(jie)法(fa)(fa)測抗(kang)(kang)體的(de)不同之處為以酶(mei)標(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)原代替酶(mei)標(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)抗(kang)(kang)體。此法(fa)(fa)中(zhong)受檢標(biao)(biao)(biao)本(ben)(ben)不需(xu)稀釋，可直接(jie)用(yong)于測定，因此其敏(min)感度相(xiang)對高于間接(jie)法(fa)(fa)。乙肝標(biao)(biao)(biao)志(zhi)物(wu)中(zhong)抗(kang)(kang)HBs的(de)檢測常采用(yong)本(ben)(ben)法(fa)(fa)。本(ben)(ben)法(fa)(fa)關鍵在于酶(mei)標(biao)(biao)(biao)抗(kang)(kang)原的(de)制備，應(ying)根據(ju)抗(kang)(kang)原結構的(de)不同，尋找合適的(de)標(biao)(biao)(biao)記(ji)方法(fa)(fa)。

基質金屬蛋(dan)白酶（MMP-2）ELISA 試劑盒(he)

親和素是一種(zhong)糖蛋白，一分(fen)(fen)子親和素可以(yi)與(yu)四個生物素小(xiao)分(fen)(fen)子發生專一親和作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)，類似抗原與(yu)抗體親和。它們(men)之間的(de)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)力是(shi)目前已知強的(de)非共價作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)。80年代后，隨著生物素-親合素系統（BAS）作(zuo)用(yong)被(bei)發現(xian)，這一親(qin)和作(zuo)用(yong)被(bei)結合應(ying)(ying)用(yong)到ELISA技術上，大(da)大(da)提(ti)高了(le)后者反(fan)應(ying)(ying)的靈敏性與專(zhuan)一性。生物素很易(yi)與蛋白(bai)質（如抗體等）以(yi)共價鍵結合。這樣，結合了(le)酶(mei)的親和素分子與結合有特異(yi)性(xing)抗體的生(sheng)物(wu)素分子產生(sheng)反應(ying)，既起到(dao)了(le)多級放大(da)作用，又(you)由于酶(mei)在遇到(dao)相應(ying)底物(wu)時的催化作用而呈色，達(da)到(dao)檢測未知抗原（或抗體(ti)(ti)）分子的(de)目的(de)。

操作程(cheng)序

1.   分別設(she)空(kong)白(bai)孔(kong)(kong)(kong)（空(kong)白(bai)對照孔(kong)(kong)(kong)不加(jia)樣品及酶(mei)標試劑，其(qi)余各步操(cao)作相同(tong)）、標準品孔(kong)(kong)(kong)、待測樣品孔(kong)(kong)(kong)。在酶(mei)標包被板上標準品孔(kong)(kong)(kong)中加(jia)入標準品50μl；在酶標包(bao)被板上待測樣品(pin)孔(kong)中先加樣品(pin)稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。每孔加入酶標試劑50μl，空(kong)白孔除外。輕輕晃動(dong)混勻(yun)，37℃溫(wen)育60分鐘。

2.   棄去液體(ti)，甩干，每孔加滿稀釋后洗(xi)滌(di)液，振(zhen)蕩(dang)30秒，甩去洗滌液，用吸(xi)水(shui)紙拍干。如此重復5次，拍干。

3.   每孔先加入顯(xian)色劑A50μl，再加入(ru)顯(xian)色劑B50μl，輕(qing)輕(qing)震(zhen)蕩(dang)混勻，37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標板，每(mei)孔加終止液50μl，終止反應(ying)（此時(shi)藍色(se)立轉黃色(se)）。

5.   測定：以空(kong)白孔調零，在450nm波(bo)長(chang)下(xia)測量各孔的吸光度(du)值（OD值）。 測定(ding)應在加終止液后15分(fen)鐘以(yi)內(nei)進行(xing)。

6.   根據標準品的濃(nong)度及對應的OD值計算出標準曲線(xian)的(de)直線(xian)回歸方(fang)程，再根(gen)據樣品的(de)OD值(zhi)在回歸(gui)方程上計算出對應(ying)的(de)樣(yang)品濃(nong)度(du)。也可以使(shi)用(yong)各種應(ying)用(yong)軟件來計算。應(ying)記住由于樣(yang)品稀(xi)釋(shi)了(le)的(de)，其(qi)實際濃(nong)度(du)應(ying)該(gai)乘以總(zong)稀(xi)釋(shi)倍數。