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心肌(ji)(ji)肌(ji)(ji)鈣蛋白I（cTn-I）ELISA 試劑盒(he)

雙位點一步法

在雙(shuang)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)夾心法測定(ding)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)時，如應用針對(dui)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)分子上兩個不同抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)決(jue)定(ding)簇的單克隆抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)分別(bie)作(zuo)為(wei)固相(xiang)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)和酶(mei)標抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)，則在測定(ding)時可使(shi)標本的加入和酶(mei)標抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的加入兩步并作(zuo)一(yi)步。這種(zhong)雙(shuang)位點一(yi)步不但(dan)簡化(hua)了操(cao)作(zuo)，縮短了反應時間，如應用高親(qin)和力的單克隆抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)，測定(ding)的敏感性和特異性也顯著提(ti)高。單克隆抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的應用使(shi)測定(ding)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)的ELISA提(ti)高到新(xin)水平。

在(zai)一步(bu)法測(ce)定(ding)中(zhong)，應(ying)注(zhu)意鉤狀(zhuang)效應(ying)（hookeffect），類(lei)同(tong)于(yu)沉淀(dian)反應(ying)中(zhong)抗(kang)(kang)原過剩的后帶現象。當標(biao)本中(zhong)待測(ce)抗(kang)(kang)原濃度相當高(gao)時(shi)，過量(liang)抗(kang)(kang)原分別和固相抗(kang)(kang)體(ti)及(ji)酶標(biao)抗(kang)(kang)體(ti)結合，而不(bu)再形成夾心復合物，所得結果(guo)(guo)將低于(yu)實際含量(liang)。鉤狀(zhuang)效應(ying)嚴重(zhong)時(shi)甚至可出現假陰性結果(guo)(guo)。

間接法測抗體

間接法

間(jian)接法(fa)是檢測抗體(ti)(ti)常(chang)用(yong)的方法(fa)，其(qi)原理(li)為利用(yong)酶標記的抗體(ti)(ti)以(yi)檢測已與固相結合(he)的受檢抗體(ti)(ti)，故稱為間(jian)接法(fa)。操作步(bu)驟如下：

⑴將特異性抗原與固相(xiang)(xiang)載體連接，形成固相(xiang)(xiang)抗原：洗滌除(chu)去未結合(he)的抗原及雜質。

⑵加稀釋的受檢血(xue)清(qing)：其(qi)中(zhong)的特異抗體(ti)與抗原結(jie)合，形成固(gu)相抗原抗體(ti)復合物。經(jing)洗滌后，固(gu)相載(zai)體(ti)上只(zhi)留下特異性抗體(ti)。其(qi)他抗體(ti)及血(xue)清(qing)中(zhong)的雜質由于(yu)不能與固(gu)相抗原結(jie)合，在洗滌過程中(zhong)被洗去。

⑶加(jia)酶標(biao)抗抗體(ti)(ti)：與(yu)固相復合物中的抗體(ti)(ti)結合，從而使(shi)該抗體(ti)(ti)間(jian)接(jie)地標(biao)記上酶。洗滌后，固相載(zai)體(ti)(ti)上的酶量就(jiu)代(dai)表特異性(xing)抗體(ti)(ti)的量。例如欲(yu)測人對(dui)某種(zhong)疾病的抗體(ti)(ti)，可用酶標(biao)羊抗人IgG抗體(ti)(ti)。

⑷加底物顯色：顏色深度代表標本(ben)中(zhong)受檢抗體的(de)量。

本法主要用于對(dui)病(bing)原體(ti)抗(kang)(kang)體(ti)的檢測而進行傳染病(bing)的診斷。間接法的優點是(shi)只要變換包被(bei)抗(kang)(kang)原就可利用同一酶(mei)標抗(kang)(kang)抗(kang)(kang)體(ti)建立檢測相應抗(kang)(kang)體(ti)的方法。

間接法(fa)成功的(de)關(guan)鍵在于(yu)抗原(yuan)的(de)純度。雖然有時用粗提(ti)抗原(yuan)包被(bei)(bei)也(ye)能(neng)(neng)取得實(shi)際有效的(de)結果，但應(ying)盡可能(neng)(neng)予以(yi)(yi)純化，以(yi)(yi)提(ti)高試驗的(de)特異性(xing)。特別(bie)應(ying)注(zhu)意除去(qu)能(neng)(neng)與(yu)(yu)一般健康人血(xue)(xue)清(qing)發(fa)生(sheng)反(fan)(fan)應(ying)的(de)雜質，例如(ru)(ru)以(yi)(yi)E.Coli為(wei)工程酶的(de)重組抗原(yuan)，如(ru)(ru)其中(zhong)(zhong)含(han)有E.Coli成份(fen)，很可能(neng)(neng)與(yu)(yu)受過E.Coli感染者血(xue)(xue)清(qing)中(zhong)(zhong)的(de)抗E.Coli抗體發(fa)生(sheng)反(fan)(fan)應(ying)。抗原(yuan)中(zhong)(zhong)也(ye)不(bu)(bu)能(neng)(neng)含(han)有與(yu)(yu)酶標抗人Ig反(fan)(fan)應(ying)的(de)物質，例如(ru)(ru)來自人血(xue)(xue)漿或人體組織的(de)抗原(yuan)，如(ru)(ru)不(bu)(bu)將其中(zhong)(zhong)的(de)Ig去(qu)除，試驗中(zhong)(zhong)也(ye)發(fa)生(sheng)假(jia)陽性(xing)反(fan)(fan)應(ying)。另外如(ru)(ru)抗原(yuan)中(zhong)(zhong)含(han)有無關(guan)蛋(dan)白(bai)，也(ye)會因(yin)競爭吸附而(er)影響包被(bei)(bei)效果。

間接法中另一種干擾因(yin)素為正常血清中所(suo)含的(de)(de)高濃度(du)的(de)(de)非特異性抗體。病人血清中受檢(jian)的(de)(de)特異性IgG只(zhi)占總IgG中的(de)(de)一小部分。IgG的(de)(de)吸附(fu)性很強，非特異IgG可直接吸附(fu)到固相(xiang)載體上，有時也可吸附(fu)到包(bao)被抗原的(de)(de)表面。因(yin)此在間接法中，抗原包(bao)被后一般用無關蛋白(bai)質(zhi)（例如牛(niu)血清蛋白(bai)）再(zai)包(bao)被一次，以封閉（blocking）固相(xiang)上的(de)(de)空(kong)余間隙。另外，在檢(jian)測過(guo)程中標本須(xu)先行(xing)稀釋（1:40~1:200），以避免過(guo)高的(de)(de)陰(yin)性本底影響結果(guo)的(de)(de)判斷。

心肌肌鈣蛋白I（cTn-I）ELISA 試劑(ji)盒

定性測定
　　　定性(xing)(xing)測(ce)(ce)定的(de)結(jie)果判(pan)斷(duan)是對受檢標(biao)本(ben)中是否(fou)含有(you)待測(ce)(ce)抗原或抗體作(zuo)出(chu)"有(you)"或"無(wu)"的(de)簡單回答(da)，分別用(yong)"陽性(xing)(xing)"、"陰性(xing)(xing)"表(biao)示。"陽性(xing)(xing)"表(biao)示該(gai)(gai)標(biao)本(ben)在該(gai)(gai)測(ce)(ce)定系統中有(you)反應(ying)。"陰性(xing)(xing)"則為無(wu)反應(ying)。用(yong)定性(xing)(xing)判(pan)斷(duan)法也可(ke)得到半定量(liang)結(jie)果，即用(yong)滴(di)(di)度來表(biao)示反應(ying)的(de)強(qiang)度，其實質仍(reng)是一個定性(xing)(xing)試驗。在這種半定量(liang)測(ce)(ce)定中，將(jiang)標(biao)本(ben)作(zuo)一系列稀(xi)釋后進行試驗，呈陽性(xing)(xing)反應(ying)的(de)高(gao)稀(xi)釋度即為滴(di)(di)度。根(gen)據滴(di)(di)度的(de)高(gao)低，可(ke)以判(pan)斷(duan)標(biao)本(ben)反應(ying)性(xing)(xing)的(de)強(qiang)弱，這比觀察不稀(xi)釋標(biao)本(ben)呈色(se)的(de)深淺(qian)判(pan)斷(duan)為強(qiang)陽性(xing)(xing)、弱陽性(xing)(xing)更具定量(liang)意義。

在間接法(fa)和夾(jia)心法(fa)ELISA中，陽(yang)性(xing)(xing)孔呈色深(shen)(shen)于(yu)陰性(xing)(xing)孔。在競(jing)爭法(fa)ELISA中則相反，陰性(xing)(xing)孔呈色深(shen)(shen)于(yu)陽(yang)性(xing)(xing)孔。

操作程序

1.   分別設空(kong)白孔（空(kong)白對照孔不(bu)加(jia)樣品(pin)及酶(mei)標(biao)試劑(ji)，其余各步操作相同）、標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)孔、待測(ce)樣品(pin)孔。在(zai)酶(mei)標(biao)包被板上標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)孔中加(jia)入(ru)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)50μl；在酶標包(bao)被板上待測樣(yang)品孔中先(xian)加樣(yang)品稀釋液(ye)40μl，然后再加待測(ce)樣品10μl（樣(yang)品zui終稀(xi)釋度為5倍）。每孔(kong)加入酶(mei)標試劑(ji)50μl，空白孔除外。輕(qing)輕(qing)晃動混勻(yun)，37℃溫育60分鐘。

2.   棄去液體，甩干，每孔加(jia)滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去(qu)洗滌(di)液，用(yong)吸(xi)水(shui)紙拍干。如(ru)此重復5次，拍(pai)干。

3.   每孔先加入(ru)顯(xian)色劑A50μl，再(zai)加入顯色劑(ji)B50μl，輕輕震(zhen)蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標(biao)板，每孔加終(zhong)止液50μl，終止反應（此時(shi)藍(lan)色立轉(zhuan)黃色）。

5.   測定：以空白孔調零，在450nm波長下(xia)測量各孔的(de)吸光度值（OD值(zhi)）。 測(ce)定應在加終止液后15分鐘(zhong)以內進行。

6.   根據(ju)標(biao)準品的(de)濃度及對應的(de)OD值計算出標準曲線的(de)(de)直線回歸方(fang)程，再(zai)根(gen)據樣品的(de)(de)OD值在回歸方程(cheng)上計算出對應(ying)的樣品濃度(du)。也可以使用各種應(ying)用軟件來計算。應(ying)記住由于(yu)樣品稀釋(shi)了的，其實(shi)際(ji)濃度(du)應(ying)該乘(cheng)以總稀釋(shi)倍(bei)數。