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內脂素（VF）ELISA 試劑(ji)盒

用于標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩定；反應產物易于顯現；能商品化生產。當前應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用廣。 

過氧化物酶

過氧化物酶(mei)廣(guang)泛分(fen)布于(yu)植物中(zhong)，辣根(gen)中(zhong)含量高，從(cong)辣根(gen)中(zhong)提取的稱辣根(gen)過氧化物酶(mei)（HRP），是(shi)由(you)無(wu)色酶(mei)蛋(dan)白和(he)(he)深(shen)棕色的鐵卟啉構成的一(yi)種(zhong)糖蛋(dan)白（含糖量18%），分(fen)子量約(yue)40 000，約(yue)由(you)300個氨基酸組(zu)成，等電點(dian)為pH 3-9，催化反應的適pH值因供氫體不(bu)同而稍有(you)差異，一(yi)般(ban)多在pH 5左右(you)。此酶(mei)溶(rong)于(yu)水(shui)和(he)(he)50%飽和(he)(he)度以(yi)下的硫酸銨(an)溶(rong)液。酶(mei)蛋(dan)白和(he)(he)輔(fu)基的大吸收光譜分(fen)別為275nm和(he)(he)403nm。

酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275

純(chun)酶(mei)的(de)RZ多在3.0以上(shang)(shang)，高為(wei)(wei)3.4。RZ在0.6以下(xia)的(de)酶(mei)制品(pin)為(wei)(wei)粗酶(mei)，非酶(mei)蛋白約(yue)占 75%，不(bu)(bu)能用(yong)于標記。RZ在2.5以上(shang)(shang)者方可用(yong)于標記。HRP的(de)作用(yong)底物(wu)為(wei)(wei)過氧化(hua)氫，催化(hua)反(fan)(fan)應(ying)(ying)時(shi)的(de)供氫體有幾種(zhong)：（1）鄰苯(ben)二胺（OPD），產物(wu)為(wei)(wei)橙色(se)(se)(se)，可溶(rong)性，敏(min)感性高，大吸(xi)(xi)收值在490nm，可用(yong)肉眼觀察(cha)判(pan)別，容易被濃H2SO4終(zhong)止反(fan)(fan)應(ying)(ying)，顏色(se)(se)(se)可在數(shu)小時(shi)內不(bu)(bu)改變,是(shi)目前國內ELISA中常用(yong)的(de)一種(zhong)；（2）聯大茴香胺（OD）,產物(wu)為(wei)(wei)橘黃色(se)(se)(se)，大吸(xi)(xi)收值在400nm，顏色(se)(se)(se)較(jiao)穩定(ding)；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產物(wu)為(wei)(wei)深棕色(se)(se)(se)，大吸(xi)(xi)收值在449nm，部分(fen)溶(rong)解(jie)，敏(min)感性較(jiao)差；（4）鄰聯甲(jia)苯(ben)胺（OT）產物(wu)為(wei)(wei)藍色(se)(se)(se)，大吸(xi)(xi)收值在630nm，部分(fen)溶(rong)解(jie)，不(bu)(bu)穩定(ding)，不(bu)(bu)耐酸，但反(fan)(fan)應(ying)(ying)快(kuai)，顏色(se)(se)(se)明顯。

內脂素(su)（VF）ELISA 試劑盒(he)

定性測定
　　　定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)(xing)測(ce)定(ding)(ding)(ding)的(de)(de)結果判(pan)斷(duan)(duan)是對受(shou)檢標本中(zhong)是否含(han)有(you)待(dai)測(ce)抗(kang)原或抗(kang)體作(zuo)出"有(you)"或"無(wu)"的(de)(de)簡單回答(da)，分別(bie)用"陽(yang)性(xing)(xing)(xing)"、"陰性(xing)(xing)(xing)"表示(shi)。"陽(yang)性(xing)(xing)(xing)"表示(shi)該標本在(zai)該測(ce)定(ding)(ding)(ding)系(xi)(xi)統中(zhong)有(you)反應(ying)。"陰性(xing)(xing)(xing)"則(ze)為(wei)無(wu)反應(ying)。用定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)(xing)判(pan)斷(duan)(duan)法也可(ke)得到半定(ding)(ding)(ding)量結果，即用滴度(du)(du)(du)來表示(shi)反應(ying)的(de)(de)強(qiang)度(du)(du)(du)，其(qi)實(shi)質仍是一(yi)個定(ding)(ding)(ding)性(xing)(xing)(xing)試驗(yan)(yan)。在(zai)這(zhe)(zhe)種半定(ding)(ding)(ding)量測(ce)定(ding)(ding)(ding)中(zhong)，將標本作(zuo)一(yi)系(xi)(xi)列稀(xi)釋后進行試驗(yan)(yan)，呈(cheng)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)反應(ying)的(de)(de)高(gao)稀(xi)釋度(du)(du)(du)即為(wei)滴度(du)(du)(du)。根據滴度(du)(du)(du)的(de)(de)高(gao)低，可(ke)以判(pan)斷(duan)(duan)標本反應(ying)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)強(qiang)弱(ruo)(ruo)，這(zhe)(zhe)比觀察不(bu)稀(xi)釋標本呈(cheng)色的(de)(de)深淺判(pan)斷(duan)(duan)為(wei)強(qiang)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)、弱(ruo)(ruo)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)更具定(ding)(ding)(ding)量意(yi)義。

在間(jian)接法(fa)(fa)和夾心法(fa)(fa)ELISA中(zhong)，陽性(xing)孔呈(cheng)色深于(yu)陰性(xing)孔。在競爭(zheng)法(fa)(fa)ELISA中(zhong)則相(xiang)反(fan)，陰性(xing)孔呈(cheng)色深于(yu)陽性(xing)孔。

操作程序

1.   分(fen)別設(she)空白(bai)孔(kong)（空白(bai)對照孔(kong)不加樣品及酶標(biao)(biao)試(shi)劑，其(qi)余各步操作相(xiang)同）、標(biao)(biao)準品孔(kong)、待測(ce)樣品孔(kong)。在酶標(biao)(biao)包被板上(shang)標(biao)(biao)準品孔(kong)中(zhong)加入(ru)標(biao)(biao)準品50μl；在酶標包被板(ban)上待測樣品(pin)孔中先加樣品(pin)稀釋(shi)液40μl，然后再加待測(ce)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍(bei)）。每(mei)孔加(jia)入酶標試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動混勻，37℃溫育60分鐘(zhong)。

2.   棄(qi)去液(ye)體，甩干，每孔加滿稀釋后(hou)洗滌(di)液(ye)，振(zhen)蕩(dang)30秒，甩去(qu)洗滌液(ye)，用吸水(shui)紙拍干(gan)。如(ru)此重復(fu)5次，拍(pai)干。

3.   每(mei)孔先加入顯(xian)色劑A50μl，再加入(ru)顯(xian)色劑B50μl，輕輕震蕩混勻(yun)，37℃避光顯色15分(fen)鐘(zhong).

4.   取出酶標板，每孔加終止液50μl，終止反(fan)應（此時藍色立(li)轉黃色）。

5.   測定：以空(kong)白孔調零(ling)，在(zai)450nm波長下測量各(ge)孔的吸光度值（OD值）。 測定應在加終止(zhi)液(ye)后(hou)15分鐘以(yi)內(nei)進行。

6.   根據標(biao)準品的濃度(du)及對應的OD值計算出標準曲線(xian)的直線(xian)回歸方程，再根據樣品(pin)的OD值在回(hui)歸方程上(shang)計算出對應(ying)(ying)的(de)樣(yang)品濃(nong)度。也(ye)可(ke)以(yi)使用(yong)各種應(ying)(ying)用(yong)軟件來計算。應(ying)(ying)記住(zhu)由(you)于樣(yang)品稀(xi)(xi)釋了的(de)，其實際濃(nong)度應(ying)(ying)該乘(cheng)以(yi)總稀(xi)(xi)釋倍數。